PCR引物合成具體操作步驟

PCR中引物的作用：找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。

引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與目的基因一端的一條DNA模板鏈互補，另一個引物與目的基因另一端的另一條DNA模板鏈互補。

PCR引物合成是指通過測定引物的OD值，溶解引物，最終合成引物的一個完善的過程。目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶聯以及起始反應物比較穩定的特點。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相鄰的核苷酸通過3′→5′磷酸二酯鍵連接。

       引物合成圖

PCR引物合成具體操作步驟：

1、是將預先連接在固相載體上的活性基團被保護的核苷酸與三氯yi酸反應，脫去其5′-羥基的保護基團DMT，獲得游離的5′-羥基。

2、合成DNA的原料，亞磷酰胺保護核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷ya 磷酸活化中間體，它的3′端被活化，5′-羥基仍然被DMT保護，與溶液中游離的5′-羥基發生縮合反應。

3、帶帽(capping)反應，縮合反應中可能有極少數5′-羥基沒有參加反應(少于2%)，用yi酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續發生反應，這種短片段可以在后續環節根據實驗需要來選擇純化方式分離掉。引物合成圖

4、在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉變為更穩定的磷酸三酯。

   　經過以上四個步驟，一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯yi酸脫去它的5′-羥基上的保護基團DMT，重復以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去。合成過程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率。通過an水高溫處理，連接在CPG上的引物被切下來，通過OPC, PAGE等手段純化引物，成品引物用C18濃縮,脫鹽，沉淀。沉淀后的引物用水懸浮，測定OD260定量，根據定單要求分裝。