細胞培養中的污染類型及相應的解決辦法

細胞培養在生物學中的正規名詞為細胞培養技術，也叫細胞克隆技術。細胞培養本身就是細胞的大規?？寺　＜毎囵B技術可以由一個細胞經過大量培養成為簡單的單細胞或極少分化的多細胞，這是克隆技術必不可少的環節，而且細胞培養本身就是細胞的克隆。通過細胞培養得到大量的細胞或其代謝產物。因為生物產品都是從細胞得來，所以可以說細胞培養技術是生物技術中最核心、最基礎的技術。

細胞培養中常見的生物污染包括細菌污染、霉菌污染、支原體污染、黑點污染、真菌污染和原生動物污染。這些污染在細胞培養中的特點及相應的解決辦法如下：

1.細菌污染

細菌在普通倒置顯微鏡下呈黑色和細砂狀。根據感染菌的種類不同，可能會呈現不同的形狀，培養液一般會變得渾濁、黃色，對細胞生長有明顯影響。

解決方法：

仔細檢查器具的滅菌情況，確保通風時間和高壓滅菌器的壓力是否足夠。最重要的是，與培養基接觸的移液管等物品如果被污染兩次，則可能會導致儲存溶液也受到污染。所以一定要注意！下次使用前要檢查培養基的渾濁度。此外，建議在培養基中添加抗生素。

2.霉菌污染

正常情況下，培養基在 37℃ 培養箱中培養兩三天，在倒置顯微鏡下仍保持透明，無雜質。一旦出現絮狀雜質，顯微鏡下可見絲狀和團塊狀漂浮物，菌絲明顯。此時，雖然細胞仍在生長，但它們的生命狀態會在長時間后逐漸惡化。

解決方法：

用硫酸銅溶液擦拭 CO2 培養箱，向托盤中加入飽和硫酸銅或消毒后加入飽和磷酸氫二鈉高鹽溶液，避免霉菌污染。

如果霉菌污染，暫時轉移所有細胞，并立即徹底使用 guo 氧乙酸溶液擦拭培養箱，包括層板和內壁。將 guo 氧乙酸放在培養箱中一小時，使蒸汽擴散，待 guo 氧乙酸氣味消散后，將細胞轉移到培養箱中。值得注意的是，培養箱需要每兩個月定期清洗一次，尤其是在梅雨季節。用 84 消毒液、清水和 75% 酒精連續擦拭培養箱，用紫外線照射也是一種有效的方法。

為防止霉菌污染，需添加 3μg/ml 兩性霉素、霉素抑制素、fang 線菌素 D 或青霉素鏈霉素。一旦被污染，就不可能恢復，即使使用上述抗生素，也沒有什么區別。對于支原體污染的細胞培養，最好選擇是丟棄污染的培養物，并用使用新鮮的無支原體的儲存液，徹底消毒環境。如果所有的細胞都被污染了，那可能是整個培養系統污染了。因此，必須對培養基和實驗設備進行檢查。如果只是個別污染，可能是操作問題，有必要注意實驗操作步驟的規范。

3.支原體污染

支原體是隱蔽的污染物，不能通過過濾去除。顯微鏡下沒有任何可見的支原體污染跡象，比如細胞病變和濁度或 pH 值變化（即使在嚴重污染的培養基中），這樣就會導致我們產生錯誤的安全感。而在牛血清中，支原體是最常見的微生物之一。

解決方法：

通常的過濾滅菌方法對支原體沒有影響。細胞一旦被支原體污染，特別是對重要的細胞系，必須去除支原體，一般的方法有抗生素治療、抗血清治療和抗血清與補體聯合治療。值得注意的是，支原體最突出的結構特征是沒有細胞壁。因此，它對作用于細胞壁的生物合成抗生素（如 β-內酰胺類、萬古霉素等）完全不敏感，并且通常對多粘菌素、利福平和磺胺類藥物具有耐藥性。相反，四環素類和大環內酯類抗生素對支原體的抑制作用最強，而氨基糖苷類和氯霉素的抑制作用較弱。

4.黑點污染

黑色的游動點能穿透濾膜并在空氣中擴散。它們在低倍鏡下顯示為黑色圓點，在高倍鏡下顯示為可移動的黑色斑點。培養液也不渾濁，一般影響較小，因此細胞仍可使用。通常，黑點污染后，細胞生長良好，運動物體無明顯增加，培養基的顏色和透明度無明顯變化。在同一批血清培養的細胞中也可以發現類似的現象。

解決方法：

黑點對細胞生長狀態沒有明顯影響，細胞增殖后會自然消失，因此除了血清置換外，無需特殊處理。如果細胞可能被小的運動點污染，建議增加培養皿細胞密度，以提高細胞存活率。

5.真菌污染

真菌污染后，培養基一般清澈，保持原色。細絲可以在顯微鏡下觀察到。最初，一些真菌類似于死細胞碎片，但其中許多清晰可見，看起來像珊瑚，比較容易區分。此外，它們會慢慢長出細細的黑色細絲，因為它們生長得比較慢，不像細菌那樣容易被發現，一旦發現培養基被污染，它們將很難存活。

解決方法：

一旦被真菌污染，果斷丟棄，然后對細胞房、CO2 培養箱、器皿和培養基進行徹底消毒。

6.原生動物污染

原生動物污染后，細胞培養基變得輕微渾濁。在顯微鏡下，大量的小點來回移動。雖然此時細胞仍能生長，但繁殖速度減慢，細胞生長狀態不好，邊緣不清，變得不透明。原生動物與細胞形成共生關系。同時，原生動物與細胞競爭營養。這種共生現象非常普遍，但以細胞為主，因為原生動物的數量相對較少，因而對細胞的正常生長沒有影響，只有當它們達到一定數量時，才最終爆發成為惡性循環。

解決方法：

原生動物污染的原因有很多，如液體消毒問題、操作問題、環境問題等，如果細胞足夠，果斷丟棄被污染的細胞和復蘇細胞。如果要保留，需要購買使用相關的滅菌試劑。

 另外，污染的可能原因很多，

比如配液消毒問題、操作問題、環境問題等等。

關于培養基的無菌狀況，取培養基至培養瓶中（不加細胞），37度試培養一段時間后觀察。如果沒有細菌生長就是操作的問題。

也可以在培養基中事先加入雙抗（硫酸鏈霉素和氨芐青霉素）。但雙抗有時會影響細胞的狀態，所以在做轉染、檢測細胞某項指標前一定要撤去雙抗，以避免影響實驗結果。

避免污染辦法：

1、孵箱應定期用三氧機消毒 或者 紫外光照射，并用酒精和新潔爾滅試擦孵箱同時孵箱內的水應是三蒸水。

2、超凈臺\取材\器材\培養液\培養瓶\操作等因素。

3、超凈臺的風機不能過大，風機到6-8格。否則也可能能致霉菌污染。

4、無菌室經甲醛熏蒸消毒后，可用同等量的氨水噴灑中和，約幾小時即可進入操作。