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商品屬性
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本產品僅供科研使用.請勿用于醫藥,不能用于臨床治療診斷使用！
產品屬性：
產品名稱 規格 貨號 豬流行性腹瀉病毒定量RT-PCR檢測試劑盒 50T BJ-P7922
實驗所需但試劑盒未包含材料：
1、1.5ml 無菌低吸附離心管
2、 96 孔 qPCR 板
3、 一次性手套
4、 1000ul 、100ul 、10ul 無菌低吸附帶濾芯移液槍頭
相關設備：
1、離心機
2、渦旋振蕩器
3、熒光定量 PCR 儀
4、 1000ul 、100ul 、10ul 移液器
特點：1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。2. 引物和探針經過優化，靈敏性高。3. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。4. 特異性高，引物是根據巴西副球孢子菌高度保守區設計，不會跟其他病毒 DNA 發生交叉反應。5. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。6. 本產品只能用于科研。
規格及成分：
編號 成分 規格 試劑一 2×Probe qPCR MagicMix 500 μL（本色蓋） 試劑二 熒光PCR專用模板稀釋液 1 mL（黃蓋） 試劑三 巴西副球孢子菌qPCR引物混合液 100 μL（白蓋） 試劑四 巴西副球孢子菌qPCR探針 50 μL（棕色管） 試劑五 巴西副球孢子菌探針法qPCR陽性對照(1×10E8拷貝/μL) 50 μL（紅蓋）
豬流行性腹瀉病毒定量RT-PCR檢測試劑盒使用方法：
一、稀釋標準曲線樣品
（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備
7. 如果有 N 個樣品，最好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 陽性對照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數 DNA 提取試劑盒兼容。
三、Probe qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：
成份 N+2 個樣品管 PCR 陰性對照管 標準曲線樣品管（2-7管） 2×Probe qPCR MagicMix 10μL 10μL 各10μL 巴西副球孢子菌qPCR探針 1μL 1μL 各1μL 巴西副球孢子菌探針法qPCR引物混合液 2μL 2μL 各2μL N+2個待測DNA模板
7μL-- -- 超純水 -- 7μL -- 第7步所得標準曲線樣品稀釋液（2-7號） -- -- 各7μL（2號樣到2號管，3號樣到3號管…） 11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數進行 PCR：
過程 溫度 時間 預變性 95℃ 3 min PCR 反應（40 個循環） 95℃ 15 sec 60℃ 1 min（采集FAM通道的熒光信號） 12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA濃度的 log 值，再推算出其濃度。
豬流行性腹瀉病毒定量RT-PCR檢測試劑盒四、數據處理
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。若重復結果 Ct值小于 40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。
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