探究PCR引物的必要性

PCR引物的必要性：

1、 pcr技術(shù)的基本原理類似于dna的自然復(fù)制過程，其特異性依賴于靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

2、pcr是一種體外dna擴增技術(shù)，它依賴于dna聚合酶在模板dna、引物和四種脫氧核苷酸存在下的酶促反應(yīng)。待擴增的DNA片段及其兩側(cè)互補的寡核苷酸鏈引物通過“高溫變性-低溫退火-引物延伸”三步反復(fù)循環(huán)，使DNA片段的數(shù)量成倍增加，因此在短時間內(nèi)，我們需要大量的特異性基因片段。

3、dna聚合酶無法從頭合成與模板鏈匹配的新鏈，只能在模板鏈上以一段短小（一般幾bp至十幾bp不等）但與模板鏈配對緊密的鏈作為起始鏈，沿5->3方向合成新鏈，這個過程我們稱之為“延伸”。

4、起始鏈的合成在真核細胞體內(nèi)是由rna聚合酶（對就是轉(zhuǎn)錄時用的那個）代勞的，此酶具有從頭合成鏈的能力（即“起始”能力）之后dna合酶以這段短的rna鏈為起始，不斷延伸合成新鏈。這段短rna鏈起到了“引發(fā)”新鏈合成的功能，因此也被稱作“引物”。在原核生物中，dna分子以環(huán)狀形式存在，隨便切個口就可以以切口3端作為起始開始延伸了 （當(dāng)然人家細菌還是有操守的，為了切得方便還是門設(shè)置了一個復(fù)制起始位點）。

5、在dna新鏈延伸完畢后，真核細胞需要將作為起始鏈的rna鏈替換為dna，這個過程依據(jù)位置不同在細胞里大致有兩種處理方式：如果引物在dna鏈一端，別說了直接上端粒合酶吧；若引物位于dna鏈中間，則是由同樣具有dna延伸活性（但速度比述的dna合酶慢許多）并兼具5->3方向水解能力（這樣才能把引物rna鏈切掉）的另一種dna合酶代勞，后用dna連接酶將替換鏈和新鏈之間的小缺口填補上。原核生物等低等生物中由于有滾環(huán)復(fù)制θ復(fù)制等特殊機制存在，復(fù)制流程的細節(jié)上會有差異，并且會多一步切割并環(huán)化dna分子的步驟，不過總體機制大同小異。

可見，在生物體內(nèi)的dna復(fù)制過程是復(fù)雜的，需要多種酶先后參與進來，并且對于dna的延伸來說，引物是必不可少的。

6、在體外的pcr體系中，由于：

①出于成本考量，暫時沒有發(fā)現(xiàn)并優(yōu)化在pcr工作溫度（55°C－－95°C+）下仍具有很好活性的rna合酶、dna合酶（替換引物用）、dna鏈接酶。

②出于現(xiàn)有工藝考量，從頭合成設(shè)計好的dna短引物是相對簡單快捷的技術(shù)，并且可以省略引物的替換步驟。

因此使用短dna作為引物是必要且高效的選擇。