支原體(Mycoplasma)是最小、zui簡單的原核生物。支原體有如下特征：支原體無細胞壁結構，所以針對細胞壁的許多常見的抗生素，如青霉su 或β-內酰胺類抗生素對支原體無效；支原體大小介于細菌和病毒之間，約為0.2-0.8μm，所以部分支原體可通過0.22μm濾器，常規的過濾對支原體無效；很多支原體由于自身的生物合成能力有限而依靠宿主提供營養，所以通常吸附或散落在細胞表面和細胞之間。支原體的這些特征使細胞培養過程中存在支原體污染的風險，細胞的支原體污染已經成為一個世界性的普遍問題。
   支原體污染可能會嚴重影響細胞的狀態，使細胞的基因表達、代謝特征發生變化，導致細胞生長減緩、分化和死亡異常，嚴重影響細胞功能。這些影響因素會嚴重影響實驗結果的可靠性、可重復性和一致性，因此支原體污染的檢測非常重要。細胞培養過程中的細菌、酵母或霉菌污染在光學顯微鏡下可見，但支原體污染在光學顯微鏡下通常不可見，必須通過特定的檢測方法進行檢測。檢測支原體污染的常用方法有支原體分離培養、ELISA、發光法等特殊的生化檢測以及DNA熒光染色檢測等。上述檢測方法中，大多操作步驟相對比較煩瑣、靈敏性不高、不能區分支原體種類、需要特殊儀器或所需時間較長。而PCR法操作相對比較簡單便捷，PCR擴增后通過電泳分析即可確定是否有支原體污染，并可根據擴增片段的大小大致預測至少11種所污染的支原體種屬。如果有必要，也可以對PCR產物進行常規測序以確定具體的支原體種屬。
   支原體PCR檢測試劑盒是利用兩對引物通過巢式PCR法特異性擴增支原體基因組DNA段，從而實現對支原體的高靈敏度特異性檢測的。原核生物的rRNA堿基序列非常保守，而rRNA操縱子上編碼rRNA的DNA間隔區(space region)在各種生物種間的堿基序列差別很大，如16S和23S之間的間隔區。這個間隔區的DNA序列及長度在支原體各個種屬間既有非常保守的部分，也有較大差異的部分。在編碼16S和23S的保守區DNA上設計一對F1/R1引物，用于擴增16S和23S之間的間隔區，這就是巢式PCR的第一輪PCR (1st PCR)，用于初步鑒定是否有支原體污染；然后在編碼16S和23S rRNA的DNA間隔區的保守區上設計一條F2引物，在編碼23S rRNA的DNA上設計一條R2引物進行巢式PCR的第二輪PCR (2nd PCR)。通過巢式PCR可以大大提高檢測的特異性和靈敏度。