ELISA間接法操作步驟

 ELISA間接法實驗原理是將抗原直接固定在固相載體上，用酶標記的二級抗體去辨識一級抗體來測定抗原量，此一級抗體的特異性非常重要。間接法操作步驟具體如下：

操作步驟：
1、抗原包被過夜（12h以上）： IgG抗原，用包被液（CBS）稀釋，100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反應板中。4℃放置過夜。

抗原用量：0.1μg*100N/抗原濃度 （N為板數）
2、封閉：棄上清 加300μL/孔封閉液，37℃放置2h。
3、洗滌：用洗滌液洗3次
4、加一抗(待測樣品為細胞培養上清)：將含單克降抗體的細胞培養上清100μL /孔加到已包被的板上，空白培養基作為陰性對照，已知樣品血清（1：200稀釋于1%BSA+PBST中）作為陽性對照。37℃恒溫箱溫育2h。
測免疫效價待測樣品為小鼠血清時：采小鼠血液于常溫20min左右后放4℃至析出血清，3000r 10min離心。將含抗體的血清在已包被的板上用1%BSA+PBST連續倍比稀釋(按照1：200開始)，100μL /孔。每個樣品平行做兩份，小鼠陰性血清或空白培養基作為陰性對照，已知樣品作為陽性對照。37℃恒溫箱溫育2h。
5、洗滌：用洗滌液洗5次。
6、加二抗（酶標抗抗體）：羊抗鼠IgG-HRP，用1%BSA+PBST l ：10000稀釋，100μL／孔， 37℃恒溫箱溫育1h。
7、洗滌：用洗滌液洗5次，
8、顯色：加新鮮配制的底物溶液(TMB:H2O2=1:1)100μL/孔，37℃恒溫箱放置10min，顯示藍色。
9、終止反應、比色：加30μL/孔H2SO4終止液．顏色變黃；用酶標儀測定450nm 630nm處各孔的吸光值，陽性反應的最大稀釋度為待測樣品的效價。