RT-PCR實驗“兩步法”與“一步法”

RT-PCR 的實驗操作分為“一步法”與“兩步法”兩種。

一步法 RT-PCR 能克隆微量 mRNA 而不需構建 cDNA 文庫（即 cDNA 合成與 PCR 反應在同一 Buffer 及酶中進行，一步法完成），省略了 cDNA 與 PCR 之間的過程。兩步法 RT-PCR 首先用反轉錄酶合成 cDNA，然后以 cDNA 為模板進行 PCR，即 RNA 反轉錄與 PCR 擴增分兩步進行。

一步法 RT-PCR 與兩步法相比快速、簡便、減少了污染機會、減少了 RNA 二級結構、減少了 PCR 反應的錯配率。RT-PCR 兩步法的優勢在于存在中間產物 cDNA，便于保存；且第二步 PCR 只取逆轉錄反應產物的 1/10 進行反應，有利于 PCR 條件的調整，實驗重現性強。

兩步法可以在第二步 PCR 反應體系中加入特異性引物，其靈敏度比一步法高。

兩步法的實驗預算要低于一步法。但是由于兩步法包括第一鏈 cDNA 合成和隨后的 PCR 反應，容易產生污染問題。