實(shí)驗(yàn)中抗體應(yīng)用全面講解

     抗體是一種由漿細(xì)胞（效應(yīng)B細(xì)胞）分泌，被免疫系統(tǒng)用來(lái)鑒別與中和外來(lái)物質(zhì)如細(xì)菌、病毒等的大型Y形蛋白質(zhì)，僅被發(fā)現(xiàn)存在于脊椎動(dòng)物的血液等體液中，及其B細(xì)胞的細(xì)胞膜表面。抗體能識(shí)別特定外來(lái)物的一個(gè)獨(dú)特特征，該外來(lái)目標(biāo)被稱為抗原。實(shí)驗(yàn)中抗體應(yīng)用全面講解：

一、WB（Western Blot ）蛋白免疫印跡雜交 ： 是將蛋白樣本通過(guò)聚丙烯酰胺電泳按分子量大小分離，再轉(zhuǎn)移到雜交膜（blot）上，然后通過(guò)一抗/二抗復(fù)合物對(duì)靶蛋白進(jìn)行特異性檢測(cè)的方法。

二、IHC /ICC（Immunohistochemistry/Immunocytochemistry ）免疫組織/細(xì)胞化學(xué)是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理--抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 （熒光素、酶、金屬離子、同位素） 顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究

三、IF （Immunofluorescence ）免疫熒光：是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。它是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光基團(tuán)，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位，以及利用定量技術(shù)（比如流式細(xì)胞儀）測(cè)定含量。 ICC通過(guò)酶反應(yīng)顯色，IF主要測(cè)熒光；用的抗體和識(shí)別的表位是一樣的，做法幾乎一樣。只是標(biāo)記二抗不一樣。

1. 做流式的抗體和免疫組化的抗體是一樣的嗎?

不一定能通用。流式是用直接標(biāo)記還是間接標(biāo)記?如果是直接標(biāo)記的話，那這個(gè)抗體一般不是FITC標(biāo)記或者就是TRITC，PE之類的。如果恰好你的免疫組化，也是想用熒光素標(biāo)記的抗體來(lái)直接標(biāo)記，那就可以通用。如果你的免疫組化要用其它的標(biāo)記的話，或者是間接標(biāo)記的話，就有麻煩，因?yàn)闊晒馑氐臉?biāo)記很可能會(huì)影響二抗和一抗的結(jié)合。

2. 為什么我的抗體做WB非常好，而做不了IF，IHC等其他任何實(shí)驗(yàn)?

首先恭喜你有一個(gè)WB非常好的抗體，畢竟能獲得做WB非常好的抗體也不容易。其次，你這個(gè)抗體很可能是通過(guò)人工合成多肽得到的，和上面所述，你用來(lái)做抗原的多肽恰好被包埋在蛋白質(zhì)的中心，因此只能識(shí)別WB中線性的部分。

3. 如何選擇免疫組化抗體?

首先，一抗是選擇單克隆抗體還是多克隆抗體，單克隆抗體特異性強(qiáng)，靈敏度低;多克隆抗體靈敏度高，特異性弱。根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如果非特異多，那么選擇單克隆抗體;如果陽(yáng)性信號(hào)弱，不妨選擇多克隆抗體試試。一般家兔來(lái)源的都是多克隆，小鼠來(lái)源的是單克隆。其次是要弄明白該一抗能夠識(shí)別什么種屬的抗原，抗體說(shuō)明書上面一般注明有，比如小鼠Mus, 大鼠Rat, 人Hum。再次比較重要的是要注意一抗的來(lái)源。比如我們?cè)谌说陌┙M織中做p53的免疫組化，一抗我們采用的是小鼠來(lái)源的p53抗體，那么二抗我們一定要選擇抗小鼠的二抗比如(山羊抗小鼠，兔抗小鼠)，這一點(diǎn)非常重要。最后，一般的抗體說(shuō)明書都會(huì)注明能做什么實(shí)驗(yàn)，如果標(biāo)明了不可以做免疫組化，一定不要選擇;反過(guò)來(lái)說(shuō)，即使標(biāo)明了可以做免疫組化，也不一定能夠做，商家只會(huì)夸大其效果。

4. WB和IF的二抗是一樣的嗎?

很明顯，不是!免疫熒光抗體是用于 免疫熒光試驗(yàn)的，是用FITC或PE等標(biāo)記的抗體，結(jié)果需要紫外線激發(fā)并用熒光顯微鏡觀察WB抗體一般是HRP或堿性磷酸酶等標(biāo)記的抗體，需顯色底物(如OPDTMB等)直接顯色(肉眼)或化學(xué)發(fā)光法顯影(需特殊儀器)。

5. 做CHIP的抗體是否可以用來(lái)做WB抗體?

不一定，一般來(lái)說(shuō)做CHIP級(jí)別的抗體對(duì)抗體純度特異性方面都要求比較高，基本上能做CHIP的抗體都可以做WB。但是如果CHIP的抗體識(shí)別的是構(gòu)象表位(比如是由兩個(gè)實(shí)際靠在一起但變?yōu)榫€性結(jié)構(gòu)之后相隔很遠(yuǎn)的兩端序列)，而不是線性表位，這種CHIP抗體做不了WB。

6. 抗體說(shuō)明書上面沒有寫該抗體能夠用于某項(xiàng)實(shí)驗(yàn)怎么辦?

一般而言，抗體研發(fā)出來(lái)之后都要經(jīng)過(guò)WB，IP，IF，IHC實(shí)驗(yàn)。檔發(fā)現(xiàn)濃度不夠做IF，IHC時(shí)候，國(guó)外的抗體一般都是寫未檢測(cè)，國(guó)內(nèi)的抗體一般是不寫。所以盡量不要抱著試試的心里去嘗試，往往只會(huì)浪費(fèi)時(shí)間。你想啊，如果抗體能夠做該實(shí)驗(yàn)，他們肯定會(huì)寫上去啊。

7. 做ELISA的抗體能否用來(lái)做WB?

通常用WB抗體稀釋濃度為1:1000，IF/IHC為1:100，而如果可以做ELISA則可以稀釋1:10000。如果一個(gè)抗體用來(lái)做ELISA的，那么言外之意就是該抗體效價(jià)不高。但不是說(shuō)ELISA的抗體不能用于做WB，抗體說(shuō)明書提示做ELISA稀釋比例為1:1000，那么你可以試試1:100做做WB。