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細胞傳代培養過程及傳代問題解析

       由于培養皿的限制,細胞到達一定的密度之后它的生長速度就會放緩,所以為了讓細胞保持在對數生長期,保持細胞旺盛的分裂能力。這時候需要進行細胞傳代!
       細胞培養的雷比較的多,我遇到過比較的情況。這里可以做慢慢的分析和討論!先把基本的細胞培養的步驟貼出來!需要注意的是,懸浮細胞和貼壁細胞的傳代培養是不一樣的。
貼壁細胞傳代:
1:對于貼壁細胞來說,它需要把上清去掉,用1-2ML的PBS洗一下細胞,然后用槍吸去洗滌液,然后加入胰酶進行細胞消化。(加入1-2ML的PBS, 我是會貼壁加入到培養皿的邊緣,不能直接對著細胞加入PBS,容易把細胞都吹起來。這一步的目的是為了去掉殘余的培養基的,殘余的培養基會含有血清和一些離子等,不利于接下來的消化。此外,常見的是0.25%的胰酶。一般根據細胞皿的大小加入胰酶,對于10cm的dish,我會加入1ml的胰酶。)
2:放到37攝氏度培養箱30s-1min(我這里處理的是293T細胞,不同的細胞的消化時間是不一樣的,需要具體的去查一查,如果消化的好的細胞是會呈現流沙狀態的,上下晃動都會隨著移動的。)
3:加入含有血清的培養液終止消化,用槍把培養液吹勻。(因為含有血清可以終止胰酶的消化反應,用槍吹培養皿底是為了把殘留在底部的細胞吹起來)
4:轉移到15ml的離心管中,離心,200g 5-10min(一般我是1000rpm離心3min)
5:去掉上清液,然后用PBS 重懸細胞,加入的PBS的量是10ML。再次離心,去掉上清。
6:加入適量的培養基,把細胞重懸,然后轉移到培養皿里面。放入到37攝氏度的5%的二氧化碳培養箱。
懸浮細胞傳代:
1:對于懸浮細胞,達到匯合狀態時,懸浮培養的細胞會聚集成團塊,轉動培養瓶時培養基會變得渾濁。(GM12878非常典型,當然了,有的細胞不會聚集成團,比如說K562)
2:可以用臺盼藍溶液+自動細胞計數器或血細胞計數器,確定細胞的密度,計算需要添加的培養基體積,將培養物稀釋至建議的接種密度。
3:一般是按比例稀釋一下培養基,然后繼續傳代。(我在傳K562的時候,是會1:4的比例去傳代,保證細胞密度在1M/ML以下,能達到對數生長期,細胞處于旺盛的分裂期)
4:把細胞放入到37℃,5%的二氧化碳培養箱中,進行培養

傳代問題解決方案:
1.傳代密度過高

一旦細胞養太久至融合度過高(>90%)才傳代,容易使細胞產生老化現象,甚至是堆疊,再消化細胞時不易吹打成單顆細胞,即便再重新鋪盤傳代,細胞也無法回到原本的特性了。(如:單層細胞,沒長滿就發生堆疊現象)
解決方案:
盡量避免融合度過高,鏡下觀察融合度約達到80%即可傳代分盤。
細胞融合度:在細胞培養中指的是細胞在培養表面(培養皿/瓶)所占的比例。

2.傳代密度過低
哺乳動物貼壁培養細胞,若細胞培養到80-90%密度需要開始傳代,在傳代接種細胞密度過低,細胞間距離太遠,就無法在細胞間產生黏附及通信作用,幫助信號傳導并活化細胞;總體細胞量不足,分泌的生長因子濃度會不足以產生利于生長的微環境,以上皆會造成增殖速度遲緩或細胞死亡。
解決方案:
細胞傳代時,要進行準確的細胞計數,確保鋪盤的密度.

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