PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析與產(chǎn)物出現(xiàn)雜帶解決方案參考

       PCR產(chǎn)物是否為特異性擴(kuò)增 ，其結(jié)果是否準(zhǔn)確可靠，必須對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的分析與鑒定，才能得出正確的結(jié)論。PCR產(chǎn)物的分析，可依據(jù)研究對(duì)象和目的不同而采用不同的分析方法。

凝膠電泳分析：PCR產(chǎn)物電泳，EB溴乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。PCR產(chǎn)物片段的大小應(yīng)與預(yù)計(jì)的一致，特別是多重PCR，應(yīng)用多對(duì)引物，其產(chǎn)物片斷都應(yīng)符合預(yù)訐的大小，這是起碼條件。

瓊脂糖凝膠電泳： 通常應(yīng)用1～2%的瓊脂糖凝膠，供檢測(cè)用。

聚丙烯酰胺凝膠電泳：6～10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用于科研及檢測(cè)分析。

酶切分析：根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，用相應(yīng)的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，又能對(duì)靶基因分型，還能進(jìn)行變異性研究。

分子雜交：分子雜交是檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢測(cè)PCR 產(chǎn)物堿基突變的有效方法。

Southern印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內(nèi)部寡核苷酸)標(biāo)記后做探針，與PCR產(chǎn)物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測(cè)PCR產(chǎn)物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用于科研。

斑點(diǎn)雜交： 將PCR產(chǎn)物點(diǎn)在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內(nèi)部寡核苷酸探針雜交，觀察有無(wú)著色斑點(diǎn)，主要用于PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。

核酸序列分析：是檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性的zui 可靠方法。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)雜帶可能的原因和對(duì)應(yīng)解決方案如下：

1.引物用量偏大，引物的特異性不高。應(yīng)調(diào)換引物或降低引物的使用量。

2.循環(huán)的次數(shù)過(guò)多。適當(dāng)增加模板的量，減少循環(huán)次數(shù).3.酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好，應(yīng)降低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。

4.退火溫度偏低，退火及延伸時(shí)間偏長(zhǎng)。應(yīng)提高退火溫度，減少變性與延伸時(shí)間，也可采用二種溫度的 pcr 擴(kuò)增。以 2 度為梯度設(shè)計(jì)梯度 PCR 反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。

5.樣品處理不當(dāng)。

6.Mg2+ 濃度偏高，因適當(dāng)調(diào)整 Mg2+ 使用濃度。

7.若為 PCR試劑盒，也可能時(shí)試劑盒本身質(zhì)量有問(wèn)題。推薦使用engreen的PCR試劑盒，添加改良的DNA聚合酶，大大提高擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和保真性。