ELISA實驗操作規(guī)范

   ELISA實驗操作人員經常會遇到自己的檢測數(shù)據(jù)和相關文獻中的實驗結果差別較大，甚至相反，或與預期不一致的情況，也常常為此感到困惑。針對此現(xiàn)象現(xiàn)給您答疑解惑，引起ELISA測定結果與文獻報導不一致的原因主要有三點：標本因素、試劑因素、操作因素。

現(xiàn)就操作因素做詳細說明：

1、嚴格按照試劑說明書進行操作。

2、檢測前應將試劑放置室溫平衡半小時，洗滌液應現(xiàn)用現(xiàn)配，同時觀察濃縮洗滌液中有無結晶，若有結晶應放37℃水浴中融化后方可使用。加入底物TMB時應注意有無顏色變化，若已顯色則可能過期或變質，也不可使用。

3、加樣后及時放入孵育箱。標本較多時，要分批操作。按照說明書步驟嚴格控制操作時間，防止孵育時間人為延長，導致非特異性結合緊附于反應孔周圍，難以清洗徹底。

4、封板溫育時，各孔一定要封嚴，防止陽性標本的液體蒸發(fā)，不會引起孔間的污染，產生周邊現(xiàn)象從而導致“花板“的出現(xiàn)。

5、應保證酶標版清潔，整個操作過程中保證酶標版不接觸次氯酸。

6、加酶試劑后用吸水紙在酶標版表面輕拭吸干。

7、合理安排檢測量，以免反應板過多造成洗板等待時間長。

8、用洗板機洗板時，保證洗液注滿各孔，洗板針暢通，洗完版后好在吸水紙（選擇干凈，無塵的吸水材料）上輕輕拍干。若血清中的纖維蛋白或洗滌液中有結晶，將堵塞洗板機針孔，造成全堵或半堵狀態(tài)，以致使未結合的酶標記物不能完全洗脫，而使后底物顯色時加深，造成假陽性或花板。廢液瓶裝滿后應及時清空，以防止廢液回流對管道的污染，而使洗滌不徹底，造成花板。洗板結束后應用蒸餾水徹底清洗管道，以防止廢液在管道中的殘留。洗滌次數(shù)及加液量不可完全按照試劑說明書設定，應根據(jù)本實驗室的實際情況來設定，開展新項目前，應做好驗證工作，根據(jù)洗滌的效果來決定洗滌的次數(shù)和加液量。同時應根據(jù)儀器維護保養(yǎng)程序，定期對洗板機進行維護保養(yǎng)。

9、手動洗板時，加洗液要快速，沒有多道移液器可以使用洗瓶。洗液應新鮮配制，以免被其他試劑污染，或染菌。加好洗液后浸泡 30s-1min。甩板倒液要迅速干脆。倒液后在吸水紙上拍板，選用無粉塵和碎屑的優(yōu)質吸水紙。需要用力拍板，使孔內沒有可見液體掛壁；但也不能太重，不能讓樣品干太久。酶標板拍干后立即做后續(xù)的加液。

10、加樣量的準確與否，直接影響抗原抗體結合物的濃度，直至后顯色的深淺。吸嘴插入血清不可太深，若插入太深，吸嘴外壁可能粘連太多血清，輕微的抖動動即可將吸咀外壁的血清濺入其它包被孔中，造成交叉污染。加樣時應盡可能的垂直加樣，并加在包被孔的底部，不可加在孔的上部。標本量大時，可考慮使用排槍加試劑，可提高速度，但使用排槍時應注意吸嘴一定要裝好，不可松動，否則會影響加樣量的準確度。加樣時保持顯色劑不外流，顯色劑應避免接觸金屬器械。加終止液時應避免產生氣泡。

11、加樣時間間隔對結果也有一定的影響，在競爭抑制法試驗中，理論上應該是標本與酶標抗體混合后同時加入反應孔，若標本先于酶標抗體加入反應孔，則標本會先與包被抗體進行反應，造成特異性假陽性。若是有干擾物質存在時表現(xiàn)明顯，在公平條件下，干擾物質與包被抗體的結合能力會低于標本，而在非公平條件下，干擾物質會優(yōu)先與包被抗體進行結合，出現(xiàn)假陽性。做HBcAb項目時，若標本與酶加樣時間間隔太長，會引起吸光度的趨勢性變化，會造成吸光度的降低。特別是針對臨界值標本，出現(xiàn)假陽性。

12、洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液，各種試劑盒的洗液不要混用。洗液需要稀釋時，應按要求稀釋。配制洗液應用新鮮的和高質量的超純水或雙蒸水，電導率小于1.5μS/cm,洗液如果結晶應待其溶解后配制。配制后要測定其pH值，使其范圍在7.2-7.4之間。