PCR檢測試劑盒實驗污染原因及預防

 PCR 反應的最大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性，但極易被污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產生。

一、污染原因:

1、標本間交叉污染：

標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染；標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導致標本間污染；有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。

2、PCR 試劑的污染：

主要是由于在 PCR 試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被 PCR 核酸模板污染。

3、PCR 擴增產物污染：

這是 PCR 反應中最主要最常見的污染問題。因為 PCR 產物拷貝量大（一般為 1013 拷貝/ml），遠遠高于 PCR 檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的 PCR 產物污染，就可造成假陽就可形成假陽性。
還有一種容易忽視，最可能造成 PCR 產物污染的形式是氣溶膠污染。在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計算一個氣溶膠顆粒可含 48000 拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。

4、實驗室中克隆質粒的污染：

在分子生物學實驗室及某些用克隆質粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見。因為克隆質粒在單位容積內含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內的質粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力。其污染可能性也很大。

二、污染的預防：

進行 PCR 操作時，操作人員應該嚴格遵守一些操作規(guī)程，最 da 程度地降低可能出現(xiàn)的 PCR 污染或杜絕污染的出現(xiàn)。

1. 劃分操作區(qū)：

目前，普通 PCR 尚不能做到單人單管，實現(xiàn)完全閉管操作，但無論是否能夠達到單人單管，均要求實驗操作在三個不同的區(qū)域內進行，PCR 的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內進行：
(1) 標本處理區(qū)，包括擴增摸板的制備。
(2) 擴增區(qū)，包括反應液的配制和 PCR 擴增。
(3) 產物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產物拍照及重組克隆的制備。
(4) 各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標本制備→PCR 擴增→產物分析→產物處理。
切記：產物分析區(qū)的產物及器材不要拿到其他兩個工作區(qū)。

2. 分裝試劑：

PCR 擴增所需要的試劑均應在裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴增后的 DNA 和其他來源的 DNA：
(1) PCR 用水應為高壓的雙蒸水。
(2) 引物和 dNTP 用高壓的雙蒸水在無 PCR 擴增產物區(qū)配制。
(3) 引物和 dNTP 應分裝儲存，分裝時應標明時間，以備發(fā)生污染時查找原因。

3. 實驗操作注意事項：

盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應該注意：
(1) 戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套。
(2) 使用一次性吸頭，嚴禁與 PCR 產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染。
(3) 避免反應液飛濺，打開反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面。
(4) 操作多份樣品時，制備反應混合液，先將 dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的精確度。
(5) 最后加入反應模板，加入后蓋緊反應管。
(6) 操作時設立陰陽性對照和空白對照，即可驗證 PCR 反應的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性。
(7) 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產物氣溶膠或標本 DNA 的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少 PCR 操作過程中加樣器應該專用，不能交叉使用，尤其是 PCR 產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū)。
(8) 重復實驗，驗證結果，慎下結論。